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Fish IF共染

更新時間:2024-09-26

簡要描述:

Fish IF共染原位雜交原理:原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。IF即免疫熒光,可檢測組織或細(xì)胞中某蛋白的表達情況及定位。
原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。

Fish IF共染原位雜交原理:原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。IF即免疫熒光,可檢測組織或細(xì)胞中某蛋白的表達情況及定位。

原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。


Fish IF共染實驗步驟

1、組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

2、脫水:組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。

3、切片:石蠟經(jīng)切片機切片,攤片機撈片,62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化:根據(jù)組織固定時間長短,切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。

7、雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過夜。

8、雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。

9、孵育一抗:滴加一抗,PBS稀釋。4°過夜。后PBS洗3×5min。

10、孵育二抗:滴加相應(yīng)二抗,室溫孵育50min。后PBS洗3×5min。

11、DAPI復(fù)染核:切片滴加DAPI染液,避光孵育8min,沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

12.鏡檢拍照:切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍光;FAM(488)綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm,發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光。)

送樣運輸要求:

冰切。標(biāo)本放原位雜交固定液中,常溫運輸;冰凍切片-20°運輸。

石蠟。標(biāo)本放原位雜交固定液中,常溫運輸;石蠟切片常溫運輸。

細(xì)胞爬片。細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,密封,4度運輸。共聚焦皿

新鮮組織:組織取出后可以立即冷凍處理,后干冰運輸?shù)轿錆h進行后續(xù)冰凍切片處理。新鮮組織-80°保存。


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