更新時間:2024-09-26
Fish IF共染原位雜交原理:原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。IF即免疫熒光,可檢測組織或細(xì)胞中某蛋白的表達情況及定位。原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。
Fish IF共染原位雜交原理:原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進行雜交,從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。IF即免疫熒光,可檢測組織或細(xì)胞中某蛋白的表達情況及定位。
原位雜交(FISH、IF雙標(biāo))可以檢測靶基因與靶蛋白的共定位情況。
Fish IF共染實驗步驟
1、組織固定:組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。
2、脫水:組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟,包埋。
3、切片:石蠟經(jīng)切片機切片,攤片機撈片,62°烤箱烤片2h。
4、石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。
5、消化:根據(jù)組織固定時間長短,切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘,自然冷卻。后基因筆畫圈,根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。
6、預(yù)雜交:滴加預(yù)雜交液,37°C孵育1h。
7、雜交:傾去預(yù)雜交液,滴加含探針雜交液,恒溫箱37度雜交過夜。
8、雜交后洗滌:洗去雜交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多,可以增加甲酰胺洗滌。
9、孵育一抗:滴加一抗,PBS稀釋。4°過夜。后PBS洗3×5min。
10、孵育二抗:滴加相應(yīng)二抗,室溫孵育50min。后PBS洗3×5min。
11、DAPI復(fù)染核:切片滴加DAPI染液,避光孵育8min,沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。
12.鏡檢拍照:切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nm,發(fā)藍光;FAM(488)綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nm,發(fā)綠光;CY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm,發(fā)紅光。)
送樣運輸要求:
冰切。標(biāo)本放原位雜交固定液中,常溫運輸;冰凍切片-20°運輸。
石蠟。標(biāo)本放原位雜交固定液中,常溫運輸;石蠟切片常溫運輸。
細(xì)胞爬片。細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后,密封,4度運輸。共聚焦皿
新鮮組織:組織取出后可以立即冷凍處理,后干冰運輸?shù)轿錆h進行后續(xù)冰凍切片處理。新鮮組織-80°保存。
毓秀生物科技(上海)有限公司是一家專注于生物科技前沿技術(shù)研發(fā)和科研技術(shù)服務(wù)的公司,公司建有專業(yè)的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織病理學(xué)實驗室,為眾多生物醫(yī)藥企業(yè)、科研機構(gòu)、醫(yī)院及高校提供分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理形態(tài)學(xué)等方面科研服務(wù)。公司核心團隊曾在國內(nèi)外許多優(yōu)秀學(xué)府從事過多年研發(fā)工作,秉承“為客戶創(chuàng)造價值,為員工實現(xiàn)夢想,為社會創(chuàng)造財富"的經(jīng)營理念,堅持以技術(shù)創(chuàng)新為先導(dǎo),以服務(wù)質(zhì)量為根本,為中國生物醫(yī)藥和科學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。
毓秀生物科技(上海)有限公司
工廠地址:上海市閔行區(qū)江月路999號12號樓302室
毓秀生物科技(上海)有限公司版權(quán)所有 備案號:滬ICP備19003469號-1 總訪問量:199197 站點地圖 技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) 管理登陸